Pneumonia associada a efusão pleural

INTRODUÇÃO

A pneumonia adquirida na comunidade inclui casos de pneumonia infecciosa em pacientes que vivem independentemente na comunidade. Os pacientes que estiveram hospitalizados por outras razões durante pelo menos 48 horas antes do desenvolvimento de sintomas respiratórios também são considerados como tendo pneumonia adquirida na comunidade porque é provável que a inoculação tenha ocorrido antes da admissão. Entretanto aqueles previamente hospitalizados, por no mínimo 2 dias nos 90 dias que precederam a infecção, os institucionalizados, que receberam atibioticoterapia endovenosa, quimioterapia ou tratamento de ferida nos últimos 30 dias e os pacientes de centros hemodiálise são considerados como tendo pneumonia associada ao tratamento de saúde e por essa razão são excluídos da definição de pneumonia adquirida na comunidade. Os pacientes que contraem pneumonia mais de 48 horas depois de instituição de intubação endotraqueal e ventilação mecânica também são excluídos, uma vez que são considerados como tendo pneumonia associada ao ventilador.

O mecanismo mais comum pelo qual o pulmão é inoculado com microrganismos patogênicos é através da microaspiração de conteúdo da orofaringe, um processo que ocorre em indivíduos saudáveis durante o sono. Por conseguinte, a colonização da orofaringe por microrganismos patogênicos, como o Streptococcus pneumoniae, pode acumular microrganismos em quantidades suficientes para infectar o pulmão. O segundo mecanismo mais frequente de infecção pulmonar é a inalação de pequenas gotículas aerossolizadas em suspensão que variam de 0,5 a 1 μm de diâmetro e que podem conter microrganismos. Em vista do número limitado de microrganismos que podem chegar aos pulmões desta maneira, apenas agentes patogênicos relativamente agressivos como por exemplo o Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumophila e algumas infecções virais podem ser transmitidas desta forma. Menos comumente, o pulmão pode ser infectado como consequência de uma infecção da corrente sanguínea (hematogênica), sendo um exemplo clássico desta via de transmissão a pneumonia estafilocócica associada a sepse estafilocócica. 

O diagnóstico etiológico da pneumonia é uma tarefa cooperativa que requer Microbiologistas, Radiologistas e Clínicos. O diagnóstico da pneumonia é clínico, usando a anamnese, o estetoscópio e as radiografias de tórax. Com algumas exceções importantes, como o isolamento de Mycobacterium tuberculosis, a pneumonia não é diagnosticada no laboratório de microbiologia. Uma vez feito o diagnóstico de pneumonia, o laboratório de microbiologia pode ajudar a definir a etiologia e selecionar a terapia apropriada.

A seguir iremos relatar um caso clínico de pneumonia comunitária associada a empiema pleural em uma criança de 2 anos de idade e a partir deste relato iremos explicar os fatores de virulência do microrganismo causador da infecção, a forma como este agente foi identificado no laboratório de microbiologia e os prováveis mecanismos de resistência aos antimicrobianos encontrados nesta cepa.

RELATO DE CASO

M.A.R.E., sexo feminino, 2 anos de idade, foi levada por sua mãe a uma instituição de saúde localizada no município de Timóteo-MG, com quadro de tosse produtiva, com presença de escarro amarelado e viscoso, cansaço, febre alta e prostração. No acolhimento de enfermagem, a Mãe de M.A.R.E., relata que sua filha era muito ativa e saudável antes de adquirir uma gripe forte, e que estes sintomas de tosse e febre evoluíram muito a 2 dias atrás. A mãe relata que mesmo administrando dipirona para a criança, a sua febre não cedia. Ao exame clínico a enfermeira nota que a criança se encontra hipocorada, prostrada e chorosa. Os sinais vitais foram os seguintes: Pressão arterial (PA) = 90x60 mmHg, Frequência respiratória de 70/minuto e temperatura axilar de 40,5^oC. Imediatamente a criança é encaminhada para consulta com o pediatra no Pronto-Socorro (PS) da instituição. A mãe relata toda a história para o pediatra de plantão, que ao auscultar o pulmão da criança notou a presença de crepitação pulmonar. Com base nos sintomas da criança, o clínico solicitou os seguintes exames: Raio X de tórax, Hemograma e PCR (Proteína C Reativa). A criança é levada para a realização do exame de imagem que demonstrou a presença de infiltrado extenso na base do pulmão direito, envolvendo todo o lóbulo inferior e presença de derrame parapneumônico. A imagem do raio X é demonstrada abaixo:

Imagem 1: Imagem radiológica de M.A.R.E.
evidenciando a presença de consolidação basal
e presença de empiema pleural.
Fonte: Acervo do pesquisador.

Após a realização do exame de imagem, os exames de sangue da criança são coletados e processados pelo laboratório e os resultados são demonstrados abaixo:

HEMOGRAMA

ANALITO	RESULTADO	VALOR DE REFERÊNCIA
HEMÁCIAS	4.150.000/mm3	3.500.000-5.000.000/mm3
HEMOGLOBINA	10,4 g/dL	11,5-15,0 g/dL
HEMATÓCRITO	31,0%	34-45%
LEUCÓCITOS	35.000/mm3	4.000-10.000/mm3
BLASTOS	0%	0%
PRÓMIELÓCITOS	0%	0%
MIELÓCITOS	0%	0%
METAMIELÓCITOS	8%	0%
BASTONETES	25%	0-3%
SEGMENTADOS	60%	40-65%
EOSINÓFILOS	01%	0-5%
BASÓFILOS	0%	0-1%
LINFÓCITOS	04%	20-45%
MONÓCITOS	02%	1-10%
LINFÓCITOS ATÍPICOS	0%	0%
HEMATOSCOPIA NEUTRÓFILOS COM GRANULAÇÕES TÓXICAS E PRESENÇA DE VACUOLIZAÇÕES NO CITOPLASMA DOS NEUTRÓFILOS.

Abaixo está demonstrado a hematoscopia da paciente, com a presença de vacuolizações nos neutrófilos e granulações tóxicas:

Imagem 2: Presença de vacuolização no citoplasma dos
neutrófilos.
Fonte: Acervo do pesquisador.

Imagem 3: Neutrófilo com granulação
tóxica.
Fonte: Acervo do pesquisador.

O Resultado o PCR é demonstrado abaixo:

RESULTADO DE PCR

ANALITO	RESULTADO	VALOR DE REFERÊNCIA
PROTEÍNA C REATIVA	192 mg/L	< 6 mg/L

Com base nos exames da criança, o clínico realiza o diagnóstico de pneumonia bacteriana e realiza a internação da criança para o tratamento. 

É administrado soro endovenoso para a criança e é iniciada a terapia antimicrobiana com a seguinte associação de antibióticos: Oxacilina + Gentamicina como tratamento inicial de escolha do clínico.

A criança é submetida após 1 dia de internação a uma toracocentese (coleta do líquido pleural) no bloco cirúrgico da instituição, afim de se tentar obter a identificação do agente etiológico da pneumonia. O líquido pleural obtido pelo cirurgião se apresenta hemorrágico e extremamente turvo.

Abaixo é demonstrada a imagem do líquido pleural:

Imagem 4: Líquido pleural com aspecto turvo e hemorrágico.
Fonte: Acervo do pesquisador.

Após recebimento da amostra no laboratório, o Microbiologista de plantão realiza a coloração de Gram do sedimento do líquido pleural e observa a presença de numerosos leucócitos polimorfonucleares e a presença de numerosos diplococos Gram-positivos em forma lanceolada ou em "chama de vela", altamente sugestivos de Streptococcus pneumoniae, com esta informação em mãos, o Microbiologista reporta este resultado para o clínico responsável pelo tratamento da paciente e o mesmo altera o esquema antibiótico da criança de Oxacilina + Gentamicina para Ceftriaxona. Abaixo é demonstrada uma imagem da coloração de Gram:

Imagem 5: Gram de líquido pleural.
Note a presença de numerosos leucócitos
e numerosos diplococos Gram-positivos
em forma de "chama de vela".
Fonte: Acervo do pesquisador.

O sedimento do líquido pleural foi semeado em ágar Sangue de carneiro e incubado a 35^oC por 24 horas em ambiente contendo 3-5% de CO2 (método da vela). Após este período a placa foi analisada e notou-se a presença de colônias alfa-hemolíticas (hemólise parcial das hemácias). A imagem da placa de ágar sangue semeada é demonstrada abaixo:

Imagem 6: Colônias alfa-hemolíticas em ágar
Sangue.
Fonte: Acervo do pesquisador.

Imagem 7: Detalhe das colônias alfa-hemolíticas.
Fonte: Acervo do pesquisador.

Após o isolamento do microrganismo em ágar Sangue, foram realizados os seguintes testes de identificação: Teste de catalase, Teste de Bili-solubilidade e teste de sensibilidade à optoquina. O teste de catalase foi negativo e o teste de Bili-solubilidade foi positivo e o microrganismo apresentou-se sensível à Optoquina. Com estes resultados o microrganismo foi identificado como Streptococcus pneumoniae. Abaixo está demonstrado o teste de sensibilidade à Optoquina:

Imagem 8: Cepa de Streptococcus pneumoniae
sensível à Optoquina.
Fonte: Acervo do pesquisador.

A partir do microrganismo isolado, foi realizado o teste de sensibilidade aos antimicrobianos de acordo com as normatizações propostas pelo EUCAST 2017, pelo método de Kirby-Bauer (disco difusão) sendo testado os seguintes antimicrobianos: Oxacilina (como marcador de resistência aos Betalactâmicos), Levofloxacino, Rifampicina, Sulfametoxazol + Trimetoprim, Teicoplanina, Linezolida, Tetraciclina, Eritromicina e Clindamicina. As imagens do antibiograma serão demonstradas abaixo e o resultado da cultura estará logo em seguida:

Imagem 9: Antibiograma de Streptococcus pneumoniae.
Fonte: Acervo do pesquisador.

Imagem 10: Antibiograma de Streptococcus pneumoniae.
Fonte: Acervo do pesquisador.

RESULTADO DE CULTURA

GERME ISOLADO: Streptococcus pneumoniae
MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ENCONTRADOS: Cepa com alteração de PBP + gene erm + bomba de efluxo tet(M)
ANTIMICROBIANO	RESULTADO
Ampicilina	Sensível*
Amoxicilina	Sensível*
Piperacilina + Tazobactam	Sensível*
Ceftriaxona	Sensível*
Cefotaxima	Sensível*
Cefepime	Sensível*
Levofloxacino	Sensível
Rifampicina	Sensível
Sulfametoxazol + Trimetoprim	Sensível
Teicoplanina	Sensível
Tetraciclina	Resistente
Eritromicina	Resistente
Clindamicina	Resistente
*NOTA: PARA ISOLADOS DE LÍQUOR É NECESSÁRIO A DETERMINAÇÃO DO MIC, POIS ESTA CEPA APRESENTA ALTERAÇÃO DE PBPs

Após 20 dias de internação a criança evolui satisfatoriamente, recebendo alta hospitalar.

DISCUSSÃO

1) Descreva a patogênese da pneumonia de M.A.R.E.

R: A pneumonia pneumocócica se desenvolve quando os microrganismos se multiplicam nos espaços alveolares. Após aspiração, as bactérias crescem rapidamente no fluido nutricionalmente rico do edema. Os eritrócitos, que vazam dos capilares congestionados, acumulam-se nos alvéolos, seguidos pelos neutrófilos e pelos macrófagos alveolares. Este estado regride quando se desenvolve anticorpos específicos anticapsulares, que facilitam a fagocitose e morte do microrganismo. As manifestações clínicas da pneumonia pneumocócica aparecem de forma abrupta com calafrios intensos, com tremores e febre persistente de 39^oC a 41^oC. Frequentemente, de 1 a 3 dias antes do aparecimento dos sintomas, o paciente apresenta infecção viral do trato respiratório. Como a doença está associada à aspiração, é geralmente localizada nos lóbulos inferiores dos pulmões (por isso o nome de pneumonia lobar). Os pacientes normalmente se recuperam rapidamente após o início da terapia antimicrobiana apropriada, com completa resolução radiológica de duas a três semanas. 

Pacientes que apresentam disfunção esplênica ou submetidos à esplenectomia podem também desenvolver doença pneumocócica grave, como resultado da capacidade reduzida de eliminação dos microrganismos da corrente sanguínea e de uma produção deficiente dos primeiros anticorpos. Nestes pacientes, a doença está associada a um curso fulminante e a uma elevada taxa de mortalidade.

2) Quais os principais fatores de virulência do Streptococcus pneumoniae?

R: Cápsula: Protege a célula bacteriana da fagocitose e é considerada como seu principal fator de virulência. Devido a sua diversidade antigênica estrutural, a cápsula polissacarídica, além de fator de virulência primário, é explorada como principal alvo nas reações sorológicas para identificação e diferenciação de sorotipos.

Parede Celular: A parede celular dos pneumococos é um forte indutor de inflamação. Este fato pode ser observado pela reprodução de sintomas característicos de pneumonia, otite e meningite, após o tratamento de animais de laboratório apenas com seus componentes.

Proteína LytA: LytA é uma enzima pertencente ao grupo das autolisinas, responsável pela degradação do peptideoglicano e consequente lise celular, na fase estacionária do crescimento bacteriano e em presença de antibióticos ou outras substâncias. Atua direta e indiretamente na patogênese da infecção pneumocócica. A ação indireta é resultante da liberação dos constituintes da parede celular e de pneumolisina, que são substâncias dotadas da capacidade de causar inflamação.

Proteína PspA: A proteína de superfície PspA inibe a deposição e ativação do sistema complemento, se liga à lactoferrina, é expressa por virtualmente todos os sorotipos de maior importância e, em modelos animais, demonstrou funcionar como um antígeno que promove o desenvolvimento de anticorpos protetores.

Proteína CbpA: CbpA é considerada uma das principais adesinas de pneumococos. Através de sua ligação ao receptor de imunoglobulina periférica esta adesina induz o processo de endocitose, favorecendo a translocação dos pneumococos a partir das células epiteliais da nasofaringe para a corrente sanguínea, sugerindo a sua participação na patogênese da meningite pneumocócica.

Adesina A: Participa ativamente da ligação do microrganismo à célula hospedeira.

Pneumolisina: Esta hemolisina é uma citotoxina intracelular, sendo liberada, geralmente, quando o microrganismo sofre ação da autolisina. É tóxica para quase todos os tipos de células eucarióticas, nas quais tem a capacidade de criar poros que resultam em lise celular. Além de sua capacidade lítica, a pneumolisina expressa uma gama de outras propriedades reconhecidamente citotóxicas, entre as quais estão a diminuição dos movimentos ciliares das células do epitélio brônquico e a inibição da fagocitose. Em baixas concentrações podem ainda estimular a produção de citocinas pró-inflamatórias, a proliferação de linfócitos, e a síntese de anticorpos e, ainda, reduzir a migração de neutrófilos.

Hialuronidase: Clivam as moléculas do ácido hialurônico, tornando o tecido conjuntivo mais frouxo, facilitando desta forma a invasão bacteriana.

Neuraminidase: Clivam o as moléculas do ácido siálico ou neuramínico que fazem parte da estrutura da mucina, reduzindo a viscosidade do muco.

IgA protease: Esta enzima é capaz de degradar imunoglobulinas da subclasse A. Como estas fazem  parte de um importante mecanismo de defesa do hospedeiro, acredita-se que a produção de IgA protease possa ter um papel significativo na virulência dos pneumococos, particularmente com relação às mucosas do trato respiratório.

Pili: Essas estruturas, constituídas de múltiplas subunidades proteicas, também participam na adesão às células eucarióticas, e na formação de biofilmes, além de induzir a produção de citocinas pró-inflamatórias.

3) Quais os mecanismos de resistência aos antimicrobianos foram encontrados nesta cepa?

R: BETALACTÂMICOS

Método utilizado: Disco-difusão com Oxacilina.

Referência: Cepas com halos de inibição maiores ou iguais a 20 mm frente à Oxacilina são considerados sensíveis a todas as penicilinas e cepas com halos menores que 20 mm apresentam alguma grau de mutação nas PBPs, tendo que ser detectado o MIC para os Betalactâmicos em infecções meníngeas.

A resistência à penicilina resulta de alterações das PBPs (Proteínas ligadoras de Penicilina), responsáveis pelo alongamento dos fragmentos de peptideoglicano que estruturam a parede celular. Geralmente, o número de PBPs envolvidas (1a, 1b, 2a, 2b e 2x) determina o grau de resistência à penicilina.

PBP 1a e 2x: Associadas a baixo nível de resistência a penicilinas e alto nível de resistência a cefalosporinas.

PBP 2b: Associadas a alto nível de resistência a penicilinas.

PBP2b e 2x: Associadas à resistência a carbapenêmicos.

Abaixo está demonstrado o teste de sensibilidade a Oxacilina:

Imagem 11: Teste de sensibilidade a Oxacilina.
O halo de inibição desta cepa é de 15 mm.
Portanto a presente cepa apresenta algum grau de mutação
nas PBPs.
Fonte: Acervo do pesquisador.

TETRACICLINAS

Cepa com provável expressão fenotípica do bombas de efluxo tet(M).

MACROLÍDEOS E LINCOSAMIDAS

Método utilizado: D-teste 

Referência: A Eritromicina é um potente indutor do gene erm. Cepas com expressão do gene erm, podem apresentar resistência a Eritromicina e falsa sensibilidade à Clindamicina. Portanto em cepas que apresentam o achatamento do halo de inibição da Clindamicina próximo a Eritromicina, devem ser relatadas como sendo também resistentes a Clindamicina.

O gene erm induz a metilação da porção 23S do RNA-ribossômico bacteriano (porção 50S do ribossomo), alterando assim o seu sítio de ligação. A Eritromicina e a Clindamicina se ligam ativamente na porção 50S do ribossomo bacteriano, inibindo de forma reversível a síntese proteica bacteriana. Quando o germe expressa o gene erm, ele altera o sítio de ligação destes antimicrobianos, fazendo com que os mesmos não inibam mais a síntese proteica.

Abaixo está demonstrado o D-teste:

Imagem 12: D-teste em uma cepa de Streptococcus
pneumoniae. Note a presença do gene erm pela
resistência a Eritromicina (ERI) e Clindamicina (CLI).
Fonte: Acervo do pesquisador.

4) Referências 

1. GOLDMAN, L., AUSIELLO, D. Cecil Medicina. Vigésima terceira edição. São Paulo: Elsevier, 2008, 3458p.
2. MURRAY, P.R., et al. Microbiologia Médica. Sexta edição. São Paulo: Elsevier, 2010, 948p.
3. ROSSI, F., ANDREAZZI, D.B. Resistência Bacteriana: Interpretando o Antibiograma. São Paulo: Atheneu, 2005, 118p.
4. SOUZA, M.A., et al. Pneumonias na Criança. Jornal Brasileiro de Pneumologia, v., n. 24, p. 101-108, mar/abr. 1998.
5. TRABULSI, L.R., ALTHERTHUM, F. Microbiologia. Sexta edição. São Paulo: Atheneu, 2015, 888p.
6. WASHINGTON, C.W., et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico: Texto e Atlas Colorido. Sexta edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008, 1565p.